Establishment and Application of Loop-mediated Isothermal Amplification for Rapid Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

This study was aimed to establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), and provide a simple, sensitive, accurate and reliable tool for diagnosis of PEDV.The conservative PEDV N gene (GenBank accession number: KT799997) of PEDV was selected as a target to design six specific primers.The reaction system and temperature of LAMP were optimized, and the LAMP method for specific amplification of PEDV was established. Results showed that the PEDV LAMP detection method was established successfully, and it could detect PEDV specifically at 60℃ for 60 min,and the detection limit was 91 copies/μL, which was one hundred-fold higher than conventional RT-PCR method.75 clinical samples were detected by LAMP and PCR, respectively, the coincidence of LAMP and PCR was about 97.3%. All the data suggested that the LAMP assay had strong specificity, high sensitivity, simple operation, low equipment requirement, and was suitable for rapid detection of PEDV clinical samples.     

基于DNA双链电荷转移的Hg2+电化学生物传感器的研究

基于DNA双链电荷转移原理,利用胸腺嘧啶(thymine)与Hg~(2+)的特异性识别和计时电量法构建了一种高灵敏检测水溶液中Hg~(2+)的电化学生物传感器。该传感器将含有1个T-T碱基错配对的DNA互补双链通过Au-S键自组装在金电极表面,运用计时电量法在含有亚甲基蓝的铁氰化钾溶液中进行测定。T-T错配阻断了DNA双链内部电荷转移,而Hg~(2+)通过T-Hg~(2+)-T配位作用与双链DNA特异性结合并形成DNA双链内部电荷转移通路,引起电极表面计时电量的变化。计时电量测定结果显示:在亚甲基蓝的还原峰电位(-380m V)附近,计时电量随着溶液中的Hg~(2+)浓度的增大而增加,Hg~(2+)浓度在1.0 nmol/L~104nmol/L范围内,计时电量的变化量与Hg~(2+)浓度的对数呈良好的线性关系,线性相关系数(R2)为0.997,检测限为0.5 nmol/L(S/N=3)。干扰实验表明,该传感器对Hg~(2+)具有良好的特异性和选择性。     

家蚕核型多角体病毒LAMP可视化检测技术的建立

[目的]建立针对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的环介导等温扩增(LAMP)可视化检测技术,为生产现场进行家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持.[方法]以BmNPV多角体蛋白基因po如为扩增靶标,分别设计5组内/外引物和5条环引物,根据扩增效率筛选最佳引物组合;优化LAMP反应条件,并进行LAMP检测的特异性、敏感性及临床样本检测试验;使用羟基萘酚蓝(HNB)染色对结果进行比色观察,对简化样品处理的条件进行摸索.[结果]使用环引物后LAMP对BmNPV基因组DNA的最低检测浓度为7fg/μL,检测灵敏度得到有效提高,且反应时间缩短.建立的LAMP检测方法对靶标DNA扩增具有特异性,对样本的检出率高于常规PCR,其最低检测限是常规PCR的100倍.在反应前加入HNB,结果易判断且能减少交叉污染.感染家蚕血淋巴进行100℃煮沸处理后即可直接用于LAMP反应,既简化了操作步骤,又降低了检测成本.[结论]针对BmNPV建立的LAMP可视化检测技术具有灵敏、快捷、可靠的特点,适合用于生产现场的BmNPV感染早期诊断.     

猪细小病毒LAMP检测方法的建立

 【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒(PPV)环介导等温扩增(LAMP)方法,为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。【方法】根据GenBank公布的PPV序列,在其保守序列区域设计了多套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立了对PPV病毒DNA进行特异扩增的 LAMP检测方法,并可通过加入SYBR Green I肉眼判断结果。【结果】该方法在63℃恒温下作用45 min,PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增;其检出限量为0.23 TCID50,敏感性高;在反应结束后加入SYBR Green I肉眼判断结果,与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过对20份临床样品的LAMP检测与免疫荧光鉴定、PCR方法比对,符合率均为20/20。【结论】本研究建立的PPV LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏,操作简单、设备要求低的特点,适合用于临床PPV快速检测。     

RT-LAMP技术检测菜豆荚斑驳病毒的研究

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国对外公布的检疫性有害生物,本研究采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了一种快速、灵敏和特异的BPMV检测方法。根据BPMV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过RT-LAMP扩增得到特征性的瀑布状条带。特异性试验表明,引物对BPMV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP比RT-PCR灵敏度高1 000倍。该方法无需特殊的试剂和设备,只需在水浴锅中60℃等温扩增,整个检测周期约2~2.5 h,适合BPMV的快速、准确检测。     

利用LAMP法快速检测致病性哈维氏弧菌

从浙江宁波的发病鲈鱼(Lateolabrax japonicus)分离到1株致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) LY-1。从该菌的DNA样本中成功扩增出大小为873 bp的ToxR基因片段。DNA序列分析表明:该序列与已登录哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) ToxR基因同源性为96.57%,与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、鳗弧菌(V.anguilarum)、创伤弧菌(V.vulnificus)、费氏弧菌(V.fisheri)、溶藻胶弧菌(V.alginolyticus)、霍利斯弧菌(V.hollisae)、拟态弧菌(V.mimicus)、河弧菌(V.fluvialis)的ToxR基因相似性为27.62%~72.49%。选择哈维氏弧菌ToxR基因种内保守区段,设计1套环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的特异引物,对扩增条件进行优化实验,在65℃孵育45 min的条件下即可完成哈维氏弧菌特异性扩增,成功建立了海水致病菌-哈维氏弧菌的LAMP快速检测方法。结果分析表明:该方法对哈维氏弧菌DNA的最小检出量为1 fg,比PCR法灵敏度高3个数量级。利用LAMP方法快速检测哈维氏弧菌,目前在国内外还未见报道。     

Adsorption and corrosion inhibition behavior of mild steel by one derivative of triazole-phenylamide in acid solution

A new triazole-phenylamide derivative (DOT) is synthesized and its inhibiting action on the corrosion of mild steel in 1 mol/L HCl solution is investigated by means of potentiodynamic polarization, electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and weight loss measurements. Thermodynamic and kinetic parameters are calculated and discussed. Then the surface morphology is studied by scanning electron microscopy (SEM). Results show that DOT strongly inhibits the corrosion of Q235. The inhibition efficiency of 0.001 mol·L-1 DOT is more than 96%. Polarization curves indicate that the DOT acts as a mixed-type inhibitor, the cathodic and anodic processes of corrosion are suppressed. Thermodynamic and kinetic parameters are obtained from weight loss of the different experimental temperatures, which suggests that at different temperatures (298~333 K) the adsorption of DOT on metal surface obey Langmuir adsorption isotherm model. The adsorption processes are exothermic reaction and belong to chemisorption and physisorption.     

电化学酶传感器在有机磷农药残留检测中的应用

从识别有机磷农药的酶及识别机理、酶的固定化技术、酶固定化载体等不同角度,综述了有机磷农药电化学酶传感器的研究概况,并展望了其发展前景。     

牙鲆弹状病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

建立了牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,首先根据牙鲆弹状病毒的糖蛋白的基因保守序列,利用Primer Explorer V3软件设计了6条引物,并对LAMP反应温度和反应时间等条件进行了优化。该方法的检测限为30fgRNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、海洋双RNA病毒、病毒性出血败血症病毒以及病毒性神经坏死病毒等没有交叉反应。该方法检测时间短,在1h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明40尾石鲽鱼样品中有3尾感染HRV,与病毒分离结果一致,说明LAMP方法比较适合牙鲆弹状病毒的早期及现场诊断。     

可用于转基因产品检测中的核酸体外等温扩增技术分析

随着生物技术的快速发展,越来越多的核酸体外扩增技术应用于分子生物学研究领域。根据是否依赖于温度循环,核酸体外扩增技术可分为非等温和等温扩增两大类。核酸体外等温扩增技术由于其有快速、灵敏、不需要特殊仪器等优点,逐渐显示出其广泛应用的潜力。重点介绍了现有的几种核酸体外等温扩增技术的原理、特点及应用,并特别关注这些方法在转基因产品检测中的应用。